Sunt testele RT-PCR făcute în România, în context Covid, inexacte? Și dacă da (vei afla în rândurile următoare), cât de inexacte sunt? Sunt inexacte în ambele direcții, sau într-una singură? (ai puțintică răbdare).

Și de ce să-ți bați capul, în cele ce urmează, să citești un articol despre un test medical absolut spectaculos, dar aproape imposibil de tradus, adică explicat, în limbaj simplu.

Am să încep cu sfârșitul. Să înțelegi un fenomen presupune să-l poți descrie, destul de fidel, cu cuvinte folosite în vocabularul de zi cu zi, astfel încât să poată pricepe și un copil de 8 ani. Sau o persoană cu educație minimă spre medie.

Nu poți face asta de la început, ca un fel de compunere. Ca și în alte texte de ale mele, ca să poți deschide ochii la măiestria unui RT-PCR, sunt câteva concepte pe care trebuie să le stăpânești dinainte.

Conceptele sunt:

a. Ce sunt aceia acizi nucleici. Din ce sunt făcuți ei, cum arată, la ce folosesc.
b. Odată ce ai înțeles, cum funcționează transcrierea unui acid nucleic
c. Ce înseamnă amplificare, și de ce ne batem capul cu ea.
d. Care sunt limitele unei amplificări, și de ce ne interesează asta.
a. Acizii nucleici:

Acizii nucleici sunt codul universal din care e scrisă viața. Sunt ca niște versete din Biblie. Sunt ca niște sure din Coran. Sunt ca niște proverbe și zicători. De vreme ce știi să citești, vei fi observat deja că fiecare propoziție are cuvinte. Și fiecare cuvânt are litere. Propozițiile mai au ceva, cât să iei pauze de respirație, sau să le intonezi într-un fel în minte. Le spunem semnelor pe care le folosim ”semne de punctuație”. Acesta (!) este un semn de punctuație.
Acum citește din nou cu, sau fără, intonație. Intonație (!)

La fel, și un acid nucleic e format din cuvinte. Și fiecare cuvânt e format din litere. Cuvintele formează propoziții nucleice, între care există semne de punctuație.

Viața e scrisă din cinci litere. A. C. G. T. U. Sau Adenină. Citozină. Guanină. Timină. Uracil.
Fiecare dintre acestea cinci se numesc ”baze azotate”.
Li se spune baze azotate pentru că au nuclee de azot. E foarte posibil că originea lor e universală. Adică au venit din spațiu. Nu știu altora cum li se pare asta. Mie mi se pare grozav. Literele alfabetului nostru genetic sunt, la propriu, praf de stele.
Bazele azotate se ”înfășoară” împrejurul unui zahar foarte simplu, care se cheamă riboză. Riboza e foarte importantă în orice organism. E ”moneda de schimb” în nenumărate tranzacții celulare. E scânteia din brichetă. E casa de schimb valutar. E stația de autobuz.
Combinația dintre o bază azotată și riboză se cheamă ”nucleosid”.
O înșiruire elegantă de baze azotate pe o matrice de riboză se numește…acid ribo-nucleic. Sau ARN.
Iar dacă riboza are o formulă particulară, în care apare și un atom de oxigen, îi spunem des-oxi-riboză.

Și acum, abracadabra!

O înșiruire elegantă de baze azotate pe o matrice de desoxi-riboză se numește…acid desoxi-ribo-nucleic. Sau ADN.
ADN și ARN sunt textele străvechi care dăinuie în fiecare din noi de la începutul lumii, acum miliarde de ani. Există, în fiecare om, fie el bun, rău, deștept sau prost, un fragment al istoriei care se rescrie, și se rescrie, și se rescrie pe arborele vieții, de la cele mai simple la cele mai complicate făpturi.

Omul este o făptură complicată. Dar nu cea mai complicată făptură. Sunt specii pe Pământ al căror grad de complexitate ne depășește cu mult, dar și altele atât de simple încât le poți compara cu o agrafă de hârtie.

b. Cum funcționează transcrierea unui acid nucleic?

Degeaba ai un text dacă nu-l știi citi.

Ce face viața să existe este această proprietate copleșitoare a acizilor nucleici de a ”conține” în structura lor informație privind replicarea lor folosind elemente din mediu, dar și fabricarea de noi structuri, din ce în ce mai întortocheate. Acidul nucleic este o rețetă a vieții care conține detalii despre cum să creezi o nouă copie foarte fidelă a lui. O ”fiică” a lui. Una care seamănă perfect cu el.
Când spun perfect spun…aproape perfect. O dată la un număr de transcrieri apar greșeli. Unele greșeli stupide duc la moartea replicatorului. Altele fac posibile salturi spre un alt nivel de inteligență.

Transcrierea unui acid nucleic se petrece cu ajutorul unor ”motoare” de transcriere, a căror schemă foarte simplă e inclusă în schema oricărui ARN, sau ADN. Aceste motoare de transcriere se numesc ”transcriptaze” (ține minte cuvântul ăsta).
Chimia oricărui acid nucleic presupune un capăt, și o coadă. Prin convenție aceste capete se numesc ”3 prim” și ”5 prim”. Putea la fel de bine să le zică ”alfa și omega”, dar chimiștii nu sunt nici preoți, nici poeți.

Transcrierea unui acid nucleic se face de la capătul 3, la capătul 5, prim. La fel cum tu citești aceste rânduri de la stânga la dreapta. Așa funcționează transcriptazele care ”citesc” răbdător, literă cu literă, secvența de acid nucleic.
ARN are o singură ”pamblică” de cod. Drept urmare și niște transcriptaze simple.
ADN-ul are două ”pamblici” (sic!) de cod. Din care pricină are și…revers-transcriptaze, adică motoare care citesc de la dreapta la stânga, sau dinspre capătul 5, spre 3, prim.

Pentru cei care aveți mașini Porsche, e ca un fel de dublu ambreiaj.
Am muncit o grămadă ca să ajungem să descriem primele două litere din faimosul test RT-PCR. Și probabil deja te-ai plictisit. Nu-i bai. Poți să-ți iei o pauză și să continui altă dată. Dar dacă nu te-ai plictisit, ia un biscuite sau un colț de pită, lucrurile devin mai interesante de acum înainte.

c. Ce înseamnă amplificare, și de ce ne batem capul cu ea.

Acizii nucleici sunt niște chestii foarte, foarte mici. Atât de mici încât, prin comparație, biblia aia scrisă pe-un bob de orez e mare cât Himalaya pe lângă nucleul unei celule. Iar în celula respectivă, și mai mititel, e codul genetic al ființei, format din ARN, sau ADN.
E foarte posibil că, pus în același coșuleț, întregul material genetic al întregii umanități, miliarde și miliarde de suflete, să încapă într-un rucsac pe care să-l care lejer Iisus în spinare în timp ce merge pe apă.

Fiind niște chestii foarte, foarte mici, dar și pentru că folosesc niște litere respectiv propoziții și mai mici, e foarte greu să citești ”scrisoarea” unui acid nucleic (ARN/ ADN), darămite fragmentul din ea care te interesează pe tine, care poate că are niște zeci de mii, sau mii, de litere (baze azotate). Ce bine-ar fi să poți ”amplifica” semnalul, adică să crești cantitatea de un număr de ori încât să fie mai ușor de citit.
Intră în scenă niște copiatoare ridicol de performante care se numesc ”polimeraze”. Polimerazele, ca și transcriptazele (poți să reiei detaliile de mai sus) sunt capabile să ”reasambleze” fragmentele transcrise, înapoi în cod.
După care e aritmetică simplă. Unu devine doi, care devine patru, care devine 16, care devine….Practic, de la o copie, dacă repeți ciclul de ”copiere” de 30 – 40 de ori, ai MILIARDE de copii.

Orice test RT-PCR face, în câteva zeci de minute, ce-a făcut mama natură în câteva milioane de ani, de când primul om a mâncat semințe în savană. Stai un pic cu ideea asta. Merită să te gândești un pic la ea.
Sunt câteva obstacole tehnologice de depășit, dacă vrei să amplifici o bucățică de ADN, sau ARN.
Acidul cu pricina e destul de îndărătnic. Nu-și arată secretele decât dacă îl supui unui stress termic susținut. Mai exact trebuie să îl…fierbi. Bine, nu chiar să îl fierbi, dar aproape. Exact, aproape de temperatura de fierbere (în jur de 95 de grade), structura acizilor nucleici cedează, și din buclițe, șurubele sau dublă-elice (cum e cazul ADN-ului) devin ca panglicile, numai bune de citit.
Îți mai trebuie o polimerază, pe care strămoșii noștri când făceau PCR o luau dintr-o specie de E.Coli, o bacterie care, doamnele știu, dă infecții urinare sau (bărbații n-au să spună) diaree. E. Coli e o bacterie cu o rată foarte rapidă de reproducere.
Astfel că, la început, ”reacțiile de polimerază în lanț” (PCR) erau făcute manual, adică fragmentul de cercetat era adus până aproape de fierbere, apoi se adăugea ”zeamă de bacterie” și niște ”zeamă de primeri” (nucleotide/ nucleoside), se lăsa la răcit (un ciclu), după care o luai de la capăt.

Orice om care-a făcut o dată în viață diaree după ce-a băut apă din baltă știe că nu strică să fierbi apa, înainte s-o bei.
Primele PCR-uri sufereau din această pricină. Lasă că era laborios (mai încălzește un pic, mai pune zeamă, așteaptă, după care ia-o de la capăt). Să obții ”ampliconi”, sau ”clone” ale fragmentului de ADN/ ARN explorat dura o veșnicie, din care pricină tehnica era rezervată centrelor mari de cercetare și costa o grămadă.

Povestea seamănă aici cu primele calculatoare care ocupau clădiri, și acum tu citești de pe un telefon smart sau laptop mult mai puternic decât cel care i-a dus pe oameni pe Lună.

Chestiunea polimerazei a fost rezolvată prin anii 80 odată cu descoperirea unei enzime, la o bacterie foarte rezistentă la căldură (un extremofil), mai exact polimeraza Taq. Asta a permis ”automatizarea” procesului astfel încât să poți efectua ciclurile de replicare mult mai rapid, fără să fie nevoie să tot adaugi enzimă, pentru că Taq rezista la temperaturile extreme cerute de tehnică.
Ar însemna să mă pierd complet în pădurea cu descoperiri cât să-ți explic, astăzi, câte variante de PCR există. Cât de mult a evoluat tehnologia primer-ilor folosiți, reactivii, polimerazele utilizate, aparatura disponibila pe piață. RT-PCR a devenit, dintr-un capriciu obscur, o adevărat industrie folosită în diagnostic medical, dar și în tratamente, inovații și…vaccinuri.
Principiul de funcționare a rămas același. Este elegant. Este previzibil. Și înseamnă că de la o singură copie de acid nucleic (ARN sau ADN) poți ”amplifica” semnalul de ordinul miliardelor de ori, cât să poți ”citi” ce scrie acolo.

d. Care sunt limitele unei amplificări, și de ce ne interesează asta.

Orice amplicon are limite. Unele gene pe lumea asta sunt foarte, foarte mici, altele sunt foarte, foarte mari. Așa cum viața aduce la pachet mici ”accidente”, unele nefericite, altele extraordinare, la fel și RT-PCR nu este 100% perfect. Fiecare mașinărie, în zilele noastre, vine cu un manual de instrucțiuni și cu elemente de performanță, la fel cum tu când te sui în BMW scrie că poți merge cu 200 la oră pe Autoba(h)n. E un computer, practic, în care bagi o zeamă de acizi nucleici ”extrași” dintr-un țesut după care mașina scuipă ce i-ai cerut tu acolo.
Executat corect, RT-PCR este printre acele teste care se apropie de perfecțiune. Erori ale testului apar la un milion de cicluri, sau chiar mai rar.

Cuvântul cheie este ”executat corect”.

Oricât de mult a înaintat tehnologia, sunt totuși pași pe care îi face persoana care execută testul și care sunt foarte importanți.
E crucial ca laboratorul să fie curat. Adică nu ca la tine acasă. Curat înseamnă FOARTE curat. Adică nu ca la maică-ta acasă. Curat de curat. Curat încât proba să nu fie contaminată de curat. Curat încât să nu te trezești că ți-a căzut mătreața în eprubetă de curat. Mai curat decât într-o covrigărie. Sper că ai înțeles cât de curat.

Un test RT-PCR poate ieși greșit în două direcții:

i. Fie îți spune că e ceva acolo pe care-l căutai, dar de fapt nu e. Se cheamă un rezultat ”fals pozitiv”.
ii. Fie îți spune că nu e nimic acolo, dar de fapt era. Se cheamă un rezultat ”fals negativ”
Dacă încă mai ai păr în cap (pentru că nu ți l-ai smuls de frustrare că ți-ai risipit minute prețioase din viață citind acest articol interminabil) deja înțelegi că e mult mai probabil ca cineva să facă prostii la un RT-PCR, și deci rezultatul să iasă ”fals negativ”.
Mult mai rar se întâmplă ca rezultatul să fie ”fals pozitiv”. Dar se întâmplă.

De ce se întâmplă?

a. Probleme de curățenie. Dacă îl testezi doar pe Vasile azi, pe Gheorghiță mâine, poți steriliza corect aparatura încât să eviți contaminarea. Dar dacă folosești mașinăria „la roșu”, și muncești zi și noapte, și nu respecți procedurile standard, șansele să iasă o varză din testarea ta cresc remarcabil. Asta e o veste tristă.
b. Probleme cu ingredientele pe care le folosești. O mașină scuipă un rezultat în baza unor reacții chimice de mare finețe care, plecând de la un fragment minuscul, generează ampliconi. Dacă reactivii nu sunt buni (reagenți contaminați, spre exemplu), testele pot ieși fals pozitive.
c. Probleme cu recoltarea probei care e trimisă spre RT-PCR. E de altfel motivul pentru care instrumentele de recoltare trebuie să fie dincolo de orice reproș. Și aparatele ălea de recoltare sunt făcute tot undeva pe lumea asta. Un bețișor contaminat = un rezultat fals pozitiv.
Și uite așa ajungem la momentul când putem deschide cadoul de Crăciun:

Sunt testele RT-PCR făcute în România, în context Covid, inexacte?

Vă răspund sincer că nu știu. Până la acest moment NIMENI nu a explorat această ipoteză printr-un studiu de confirmare.
Testul în sine e foarte exact. Dar algoritmul de testare e posibil să fie viciat în mai multe centre. Veriga slabă e personalul, și procesul de extragere (extractoarele). Unele centre sunt complet automatizate (au extractoare automate), altele sunt cu extractoare manuale. Riscul de eroare e mult mai mic dacă procesul e automatizat.

DAR riscul ca testul să fie inexact merge în ambele direcții cu aceeași ”șansă” de eroare, lucru care e periculos. Adică nu avem motive să credem că există un „bias” al erorii doar în direcția testelor ”fals pozitive”.
Și chiar de-ar fi așa, mintea cocoșului îți spune că e mai periculos să primești un rezultat fals-negativ. E ca la sarcină. Dacă tu crezi că n-ai, dar ai, nu trece mult timp și afli (cinic, dar adevărat).

Un algoritm de testare viciat spune că există o disproporție de rezultate fals NEGATIVE, nu invers.
Problema cu o persoană care are simptome de COVID și află, după un test RT-PCR, că e ”negativă” (dar de fapt e pozitivă, pentru că testul e doar ”fals” negativ) e profund dilematică.

Reversul medaliei înseamnă, cel mult, că raportările zilnice cuprind un procent – să zicem 5 – 10% – de fals pozitivi. Dar cu cât munca de testare scade calitativ, posibil că vei avea 15 – 20% fals negativi.

Tu îți iei măsurile de prevenție sanitară pe baza părții ”luminoase” a poveștii. Zici că treaba merge bine, dar ți se umplu paturile ATI, și-ți crește numărul de morți. Și mai și urlă diverși avocați că ”testele sunt inexacte”.

România ar fi trebuit să treacă printr-un întreg ciclu de educație profesională a laboranților, biologilor, geneticienilor etc care lucrează la testarea RT-PCR. N-a făcut-o decât în mică măsură.

Asistenții noștri medicali au devenit mult mai buni la recoltare, la transportul probelor, la etichetarea și stocarea lor. Dar greșeli continuă să aibă loc. E foarte dureros să afirm asta. Greșeli continuă să aibă loc.
Scopul educației nu e vreodată să pleci luminat acasă. Cât să pleci preocupat, gânditor, un pic zguduit de ce ai aflat. Dar să vrei să afli mai multe.

Felicitări, acum simți ce simt și eu după ce am scris acest articol.

Gabriel Diaconu